Authors: Mikel Isasi-Vicente1, Rita Ewela Ojo1, Isabel Rodríguez-Llopis1, Vanesa Benito1, Felipe Goñi de Cerio1, Alberto Katsumiti1*
1 GAIKER Centre Technologique, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), Zamudio, Espagne
*katsumiti@gaiker.es
Dans ce travail, la ligne directrice OCDE TG 249 a été étendue selon deux axes:
(1) le remplacement des cellules branchiales RTgill-W1 par d’autres lignées cellulaires issues de la même espèce de poisson (truite arc-en-ciel), à savoir les cellules RTG-2 (gonade) et RTL-W1 (foie), afin de comparer leur sensibilité à différents matériaux avancés (AdMas) à base de graphène;
(2) la transition d’une exposition standardisée de 24 heures (court terme) vers une exposition prolongée de 28 jours (long terme).
Par ailleurs, en raison de la forte hydrophobicité de certains AdMas, notamment le graphène, un protocole de dispersion a été optimisé afin de stabiliser les suspensions et de mieux simuler les conditions d’exposition environnementales.
Différents protocoles de dispersion (par exemple, méthodes de dispersion à faible ou forte énergie) et milieux de dispersion (par exemple, milieu de culture cellulaire, DMSO, milieu conditionné, eau douce artificielle, eau douce artificielle avec matière organique naturelle [NOM]) ont été testés pour améliorer la stabilité du graphène et permettre des conditions d’exposition plus réalistes.
Une fois le protocole de dispersion établi, les cellules ont été exposées pendant 24 heures (OCDE TG 249) et jusqu’à 28 jours (version étendue de l’OCDE TG 249) à des concentrations croissantes de différents matériaux avancés à base de graphène (0,1–100 µg/mL).
Après exposition, plusieurs paramètres ont été évalués: intégrité de la membrane plasmique, activité métabolique, stabilité de la membrane lysosomale.
Les résultats ont montré que le graphène se disperse mal dans le DMSO, l’eau douce artificielle et le milieu de culture cellulaire, flottant à distance des cellules au fil du temps. Les suspensions de graphène ainsi obtenues ont montré une toxicité très faible, probablement car les cellules n’y avaient pas accès.
Le milieu conditionné, et surtout l’eau douce artificielle enrichie en matière organique naturelle (AFW+NOM), ont donné les meilleurs résultats.
Les méthodes de dispersion à faible énergie (agitation magnétique prolongée) ont permis de meilleurs résultats que les méthodes à forte énergie (bain ou sonication par pointe), qui n’ont pas amélioré la dispersion des matériaux. En outre, plusieurs études ont montré que les méthodes de dispersion par sonication peuvent induire la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et favoriser l’agglomération des particules dans les suspensions.
Ainsi, le protocole de dispersion retenu a été l’utilisation d’AFW + NOM combinée à une agitation magnétique pendant 72 h à 500 rpm (Figure 1). Ce protocole permet également de reproduire des conditions d’exposition plus réalistes et pertinentes sur le plan environnemental.
(A) Milieux testés:
(B) Méthodes de dispersion testées:
(C) Protocole final (AFW+NOM)(Adapté de Lizonova et al., 2024):
Figure 1: Graphène du JRC en solution NOM-AFW avant et après agitation magnétique pendant 72 h.
Les expositions de courte durée au graphène dans une matrice de silicone ont induit une toxicité relativement faible pour les lignées cellulaires RTgill-W1, RTG-2 et RTL-W1. Toutefois, la matrice de silicone seule s’est révélée cytotoxique pour les cellules, ce qui indique que le silicone est le principal contributeur à la toxicité observée (Figure 2).
Cela suggère une interaction potentiellement protectrice ou stabilisatrice du graphène au niveau cellulaire. Bien que cela puisse paraître contre-intuitif, étant donné le potentiel toxique bien connu du graphène dans d’autres contextes, certaines études ont rapporté que du graphène correctement dispersé peut moduler les réponses cellulaires en adsorbant des surfactants et en stabilisant les membranes cellulaires.
Le graphène à quelques couches dans une matrice d’époxy (FLG-époxy) s’est révélé cytotoxique pour les cellules RTgill-W1 et RTG-2. La résine d’époxy seule a montré une faible cytotoxicité sur les lignées RTgill-W1, RTG-2 et RTL-W1. Les cellules gonadiques (RTG-2) étaient plus sensibles que les cellules branchiales (RTgill-W1) à l’exposition au FLG-époxy (Figure 3).
Figure 2: Viabilité cellulaire exprimée par l’intégrité de la membrane cellulaire (bleu), la variation de l’activité métabolique (vert) et l’intégrité de la membrane lysosomale (rouge) des lignées (A et C) RTgill-W1 et (B et D) RTG-2 exposées pendant 24 h à (A-B) graphène + silicone et (C-D) matrice de silicone.
Figure 3: Viabilité cellulaire exprimée par l’intégrité de la membrane cellulaire (bleu), la variation de l’activité métabolique (vert) et l’intégrité de la membrane lysosomale (rouge) des lignées (A et C) RTgill-W1 et (B et D) RTG-2 exposées pendant 24 h à (A-B) FLG-époxy et (C-D) résine époxy seule.
Les résultats obtenus lors des expositions de longue durée des cellules branchiales (RTgill-W1) au graphène ont montré qu’en dépit de l’absence d’effets après 24 heures d’exposition, une diminution de la viabilité cellulaire, dépendante de la dose, a été observée entre 7 et 28 jours d’exposition. Les effets étaient particulièrement marqués après 21 et 28 jours (Figure 4).
Figure 4: Viabilité cellulaire exprimée par l’intégrité de la membrane cellulaire (bleu), la variation de l’activité métabolique (vert) et l’intégrité de la membrane lysosomale (rouge) de la lignée RTgill-W1 exposée jusqu’à 28 jours au graphène du JRC.
MACRAMÉ a reçu un financement de l’Union européenne dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon Europe, en vertu de la convention de subvention n° 101092686. Les partenaires associés (à savoir, (a) les partenaires suisses et (b) les partenaires britanniques) ont reçu un financement national de (a) la Secrétariat d’État suisse à la formation, à la recherche et à l’innovation (SEFRI), et de (b) Innovate UK.
