Antje Vennemann1, Oliver Gräb1, Emanoela Tha2, Lan Ma-Hock2, Robert Landsiedel2, Aline Chary3,
Pamina Weber3, Tommaso Serchi3, Martin Wiemann1
1IBE R&D Institute for Lung Health gGmbH, Mendelstr. 11, Münster 48149, Germany,
2 BASF SE, Carl-Bosch-Strasse 38, 67056 Ludwigshafen am Rhein, Germany
3Luxembourg Institute for Science and Technology, 41 rue du Brill, 4422 Belvaux, Luxemborg
Présentation schématique du test AMA. Quatre paramètres sont testés et quantifiés à partir du surnageant des cellules traitées 16 h après l’administration des particules. La cytotoxicité, les lésions lysosomales et le potentiel pro-inflammatoire sont reflétés par la libération de lactate déshydrogénase (LDH), de β-glucuronidase (GLU) et de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Le quatrième paramètre, le potentiel oxydatif, est quantifié à partir de la concentration de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) libérée de manière aiguë par les macrophages lors de l’exposition aux particules pendant 90 minutes.
Le test des macrophages alvéolaires (AMA) est un test in vitro de base utilisé dans MACRAMÉ pour prédire la toxicité pulmonaire des matériaux avancés (AdMas). L’AMA est un test de référence multidose validé par 19 études d’inhalation à court terme (Wiemann et al. 2016). Dans cette étude, l’AMA a permis de distinguer les matériaux « actifs » (tests complémentaires recommandés) des matériaux « passifs » (aucun test complémentaire nécessaire). Dans ce test, la lignée cellulaire de macrophages alvéolaires (NR8383) est exposée aux particules d’essai dispersées et respirables pendant 16 heures en absence de sérum. Dans MACRAMÉ, nous avons cherché à promouvoir l’AMA comme ligne directrice de l’OCDE et avons mené une étude comparative interlaboratoire. De plus, nous avons utilisé ce test comme l’analyse des risques des AdMas.
Ce qui concerne l’étude de validation, les procédures opérationnelles standardisées (SOP) de l’AMA ont été mises à la disposition des partenaires MACRAMÉ impliqués dans l’ILC (IBE, BASF, LIST). Douze suspensions stables composées de matériaux issus de la bibliothèque de matériaux MACRAMÉ ont été préparées par l’IBE, analysées en aveugle par BioMS, puis distribuées aux partenaires. La sélection des matériaux et zone de concentration a été harmonisée avec le consortium. Les plages de concentration étaient basées sur les connaissances des experts et les résultats des expériences de pré-test (IBE). Trois répétitions biologiques ont été réalisées dans chaque laboratoire.
Comme illustré ci-dessous, les douze matériaux testés ont donné lieu à un schéma de réaction différentielle qui était très congruent entre les trois laboratoires de l’ILC (IBE, BASF, LIST). Dans le cas de la formation de H2O2, les données de tous les laboratoires sont complètes et ont montré de faibles valeurs basiques et des augmentations dépendantes de la concentration pour le carbure de tungstène-cobalt (mais pas pour le carbure de tungstène) ainsi que pour les nanofils de SiC. Dans le cas de la libération de LDH, GLU et TNFα (données complétées par BASF et IBE), les résultats étaient congruents pour tous les matériaux ; les données de la libération de cytotoxicité basique (LDH < 25 % du contrôle positif) du troisième partenaire étaient très similaires et sont actuellement révisées pour répondre aux critères d’acceptation . Néanmoins, l’étude montre que l’AMA est une méthode robuste et transférable.
Les cas d’utilisation de MACRAMÉ incluent cinq matériaux avancés (AdMas) pertinents pour l’industrie. Compte tenu de leur cycle de vie, ces AdMas ont été rendus accessibles aux macrophages dans la mesure du possible, par exemple en préparant des particules inhalables par abrasion, filtration ou incinération. Néanmoins, la dispersion des matériaux nécessitait des méthodes bien adaptées, applicables également aux méthodes de test de niveau supérieur. Les exemples présentés ici illustrent la taille et l’absorption des particules par des micrographies.
Différents protocoles de dispersion ont été testés, et certains matériaux étaient encore trop volumineux pour être absorbés par les cellules ou subsistaient sous forme d’agglomérats dans le surnageant des cellules, les rendant ainsi inaccessibles aux cellules du fond. Une procédure standardisée (SOP) fournie par l’EMPA, avec une longue étape de sonication en bain, s’est avérée la dispersion la plus adaptée.
Ce UC est constitué de matériaux abrasés et incinérés provenant de composites époxy-FLG et de la dispersion de FLG elle-même. Le matériel abrasé était trop volumineux pour être absorbé par les cellules, une filtration sur une gaze de 5 µm a dû être réalisée au préalable. Cela a permis d’améliorer significativement la distribution granulométrique. Pour l’AMA, tous les matériaux appartenant à ce UC ont ensuite été dispersés uniformément. L’induction significativement élevée de TNF par la dispersion de FLG n’est pas due à une contamination par endotoxines, comme l’ont montré des tests ultérieurs.
Ce UC est constitué de films de polyuréthane cryobroyés et incinérés, chargés de nanotubes de carbone (CNT). Ces deux matériaux, cryobroyés et incinérés, se sont facilement dispersés et ont pu être facilement absorbés par les cellules. Des résultats d’AMA valides ont ainsi pu être obtenus.
Cette UC fournit des nanoparticules de PLGA chargées de ciprofloxacine pour le traitement par inhalation. Des particules de PLGA marquées par fluorescence ou à l’or sont également fournies en parallèle afin de déterminer l’absorption quantitative dans les cellules grâce à d’autres méthodes de détection, notamment l’ablation laser avec spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (LA-ICP-MS) et la spectrométrie de masse à temps de vol des ions (ToF-SIMS).
