La détection et la quantification des particules absorbées par les cellules est une étape importante pour évaluer les résultats des tests in vitro. En outre, la connaissance de l’absorption des particules et de la distribution subcellulaire est nécessaire pour corréler les résultats in vitro et in vivo. Dans le cadre de MACRAMÉ, nous avons cherché à appliquer et à développer des méthodes d’imagerie analytique à haute résolution adaptées à la détection des matériaux avancés particulaires (AdMas). Des macrophages NR8383 ont été utilisés comme système modèle et chargés de divers AdMas dans les conditions de l’essai sur les macrophages alvéolaires (AMA, voir l’affiche jointe). Les cellules ont été utilisées pour (1) la spectrométrie de masse à plasma inductif par ablation laser (LA-ICP-MS), une approche quantitative pour mesurer les éléments qui peuvent être ionisés et mesurés par une spectrométrie de masse, (2) la microscopie confocale Raman (CRM) qui peut identifier par exemple les matériaux liés au graphène, (3) la spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol (ToF-SIMS) qui peut détecter des éléments ionisés et des composés chimiques. Les méthodes de microscopie optique telles que (4.) la microscopie vidéo à intervalles réguliers, la microscopie à champ sombre amélioré et la microscopie à fluorescence ont également été des outils utiles et ont souvent été combinées avec des méthodes analytiques. Les exemples choisis montrent qu’une utilisation complémentaire et adaptée des méthodes est obligatoire pour détecter/quantifier les AdMas dans les cellules.

Détection de graphène à faible couche par ToF-SIMS et Raman

La méthode d’analyse ToF-SIMS (Tascon, Münster) a été adaptée avec succès à l’utilisation de matériaux à base de carbone grâce à la pulvérisation préalable de CS⁺ sur les échantillons. Pour cette approche, les cellules ont été incubées avec du graphène, du graphène à quelques couches (FLG) et du noir de carbone. Les préparations de cytospin ont été analysées par microscopie optique et CRM (IBE) avant l’analyse ToF-SIMS.

Figure 1: Le graphène est visible en noir à l’intérieur des cellules (a, b). (c) montre les bandes Raman caractéristiques de la position transversale de (b) confirmant la présence d’un matériau lié au graphène dans cette cellule (avec 1350 cm-1 pour la bande D, 1582 cm-1 pour la bande G et 2685 cm-1 pour la bande 2D). L’image ToF-SIMS (d) est une analyse de corrélation RGD de différents ions secondaires, rouge : rouge : PO₃-, vert : C-, et bleu : CN-.

Détection du PLGA par ToF-SIMS et microscopie à fluorescence

Le poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) est un copolymère de monomères de lactide et de glycolide qui est souvent utilisé comme vecteur de médicaments parce qu’il se dégrade facilement dans le corps humain. Dans l’étude MACRAMÉ, des particules de PLGA (environ 100 nm) chargées de l’ingrédient pharmaceutique actif ciprofloxacine ont été utilisées comme AdMa dans le domaine de la médecine pour détecter et quantifier son absorption dans les cellules. Le Lumogen Red, un colorant fluorescent, a été chargé dans les particules PLGA pour permettre la visualisation de leur absorption dans les cellules. Une méthode ToF-SIMS pour détecter le PLGA dans les cellules a été mise au point avec succès (Tascon). Compte tenu de la nature organique du PLGA, ce résultat est remarquable.

Figure 2: Analyse des cellules par microscopie à fluorescence (à droite), suivie d’une analyse ToF-SIMS (à gauche). Les cellules ont été incubées avec des particules de PLGA contenant du Lumogen Red et de la ciprofloxacine. Les images ToF-SIMS (à gauche) montrent les composants analysés PO₃- (vert), SiO₂ (bleu, support en verre) et PLGA (rouge). La signature du PLGA (spectre de masse) avait déjà été analysée pour le PLGA pur et a été détectée devant le fond organique cellulaire. Aucun signal spécifique pour la ciprofloxacine n’était détectable. Notez la grande similitude entre le PLGA et les signaux de fluorescence.

La microscopie Raman permet d’identifier le graphène à couche mince (FLG) dans les cellules

L’effet biologique du graphène à faible couche (FLG) a été comparé à celui de particules préparées à partir de FLG enrobé dans une résine époxy (FLG Epoxy, voir l’affiche ci-jointe). La bande G nette à environ 1580 cm-1 et les rapports d’intensité calculés à partir d’autres bandes distinguent le matériau du graphite et confirment qu’il s’agit bien de FLG.

Figure 3: (a) Macrophages chargés de FLG avec petite et grande inclusion noire. (b) Zone sélectionnée pour l’analyse CRM. (c) Spectre Raman avec bandes Raman caractéristiques. (d) Distribution spatiale de la bande G typique (en rouge) dans la carte Raman de (b).

Détection quantitative de matériaux dans les macrophages par LA-ICP-MS

L’ablation laser-ICP-MS a été utilisée pour quantifier les concentrations de particules dans les cellules. La quantification a été réalisée par étalonnage externe en introduisant des solutions étalons aqueuses de l’élément respectif à l’aide d’un système d’introduction double. Des préparations de cytospin de macrophages NR8383 incubés avec des nanoparticules de CeO2, WC⋅Co et Mn2O3 de différentes concentrations ont été analysées. Cela permet de comparer les concentrations par cellule directement à la concentration de particules appliquée.

Figure 4 : A Carte élémentaire de P dans la préparation de cytospin NR8383 construite à partir de données résolues dans le temps via la vitesse de balayage du laser (20 µm/s) et la taille du spot des tirs laser individuels (5 µm). Les cercles rouges indiquent les cellules qui ont été automatiquement détectées par le logiciel développé. P a été utilisé pour différencier le fond des cellules en raison de sa forte abondance endogène. Les intensités individuelles par pixel ont été additionnées pour obtenir les concentrations par cellule. B valeurs moyennes (barre) et médianes (x) de toutes les expériences avec différentes concentrations d’incubation. Les barres d’erreur représentent le SEM (n = 52 – 100).

Caractérisation des fibres à partir d’études d’absorption

Les nanofibres longues inhalables (par exemple les MWCNT) peuvent induire une phagocytose frustrée (FP) dans les macrophages qui a été reconnue comme un événement clé pour l’induction du cancer du poumon. Dans les cellules NR8383, la PF provoque la libération d’enzymes lytiques, de cytokines pro-inflammatoires et de stress oxydatif 1. Une vidéo time-lapse est un outil simple pour confirmer qu’une fibre longue peut être classée comme induisant la FP.

Figure 5 : Images tirées d’une vidéo time-lapse d’un macrophage alvéolaire (NR8383) luttant contre une nanofibre de SiC pendant 6 h. Dans ce cas typique de PF, la cellule est incapable de plier ou d’ingérer complètement la fibre.